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PacBio Sequel

核心技術

    SMRT測序 PacBio Sequel是PacBio公司繼RS、RSII系統后推出市面的第三款測序系統,核心技術是Single molecule Real-Time(SMRT)測序,即單分子實時測序,就是能夠實現單個DNA分子的測序,并且實時監控測序結果。

Sequel測序系統特點

(1) 測序通量增加7倍

      Sequel系統在SMRT Cell性能方面進行了升級,將一個Cell的密度由原來的15萬個ZMW孔增加到100萬個,換言之,一個SMRT Cell的數據產出提高了約7倍,而且在該系統推出之初平均讀長就已經達到8~12kb,使得測序達到更高通量。隨著不斷的技術改良,一個SMRT Cell的容量還將繼續提升至400~800萬個ZMW孔,甚至更多。

2) 測序成本顯著降低

      Sequel測序系統縮減了光學系統,將儀器機身大小改良為原來的1/3,相對于Illumina Hiseq的體積也小11%。但是增大了SMRT Cell運作空間。根據官方給出的數據,一臺Sequel售價35萬美元,為RSII儀器售價的一半,而在測序通量上7倍的提升更是進一步降低了測序的成本,采用目前的P6-C4試劑,平均每個SMRT Cell可產生5-10Gb的數據,按每個Gb的數據產出成本顯著降低。因此新型的Sequel測序系統非常適合進行大規模的研究,結合設立在武漢東湖綜合保稅區的菲沙基因PACBIO測序中心,將為廣大研究人員提供更多的便利。

(3)項目周期更短

       Sequel測序系統每次運行都可裝載1~16個SMRT Cell,樣本制備僅需6小時,測序時間則為0.5~6小時,從樣本制備到測序僅需1天時間就可以完成,并且可以根據實驗設計具體要求進行調整。例如3G的人類基因組,進行50×測序,利用RSII需要約150個Cell,大概要運行10輪,而現在則僅需約15個Cell運行1~2輪可以完成,大大縮短了測序工作周期。

 

應用領域
1. 全基因組de novo測序
       與二代測序最高不超過1Kb的讀長相比,PacBio Sequel的長讀長將有效解決短序列數據的拼接難題。同時,與二代測序的模板樣品需 要擴增相比,PacBio Sequel無需擴增可直接對單個分子進行測序,有效避免了PCR擴增偏好性和GC偏好性,PacBio Sequel可輕松 跨越GC含量異常(過高或過低)及高度序列重復的區域,實現序列覆蓋的完整性和均一性。
2. 基因組草圖的優化或基因組完成圖繪制

      對前期已開展測序的動植物、微生物等基因組結合三代長讀長測序數據進行完善和提升。針對前期已經開展全基因組測序,獲得基因組 草圖的動植物、微生物等,可以結合PacBio Sequel平臺長讀長reads進行補充,從而快速獲得前期沒有測得的信息及提升基因組的完 整度。另外還可以針對前期沒有檢測獲得的結構變異信息(structural-variation events)、串聯重復序列信息(tandem duplication)、易位信息(Inversion)等。尤其在微生物基因組完成圖的繪制中,可在一天之內將基因組完善獲得0 gap contig。
3. 全長轉錄本測序

       PacBio Sequel  的長讀長可實現全長轉錄本測序,并使基因可變剪接形式的識別成為可能,因此可以對新基因及其isoform進行更全面 的研究。同時,長讀長不再需要對RNA-Seq的reads進行組裝,因此可以更完整的對基因模型和轉錄的基因進行更全面的注釋,用以改 進參考基因組中的基因注釋信息。
4.  宏基因組測序

      長讀長reads能夠更為精準地鑒定水體、土壤、腸道等生境中微生物的種類的鑒定,能夠更加快捷地獲得更多微生物物種的全基因組序列。
5. 16S rDNA全長測序
      PacBio Sequel的平均讀長為8-12Kb,而16S rDNA長度大約為1540bp,因此結合該平臺測序可以成功測序獲得16S的全長序列。
6. 細胞器基因組測序
      葉綠體基因組和線粒體基因組序列都包含重復序列、反向重復序列等復雜結構,PacBio Sequel的長讀長可直接跨越這些區域獲得這些 細胞器的全基因組序列信息等,基因組組裝不依賴于是否有近緣物種的線粒體和葉綠體基因組信息等、重測序能夠檢測到全面的SNPs 及inde信息。
7. 全基因組重測序&稀有變異鑒定
      PacBio RS II  長讀長測序reads無GC偏好,能夠全面獲得基因組的遺傳變異,包括SNPs的鑒定到CNV、SV結構變異等,可運用至人 類癌癥基因組重測序等。PacBio Sequel平臺10小時即可完成測序,可應用至需要快速反饋的臨床檢測中,如細菌感染疾病中細菌的鑒 定、病毒的鑒定等,取樣開展重測序和目前已有的細菌、病毒基因組數據庫進行比對鑒定即可。
8. 表觀遺傳學
     PacBio Sequel利用測序過程聚合酶反應的動力學變化,首次實現對堿基修飾進行直接測序。當堿基有額外修飾時,DNA聚合酶的合成 速度會減慢,對應的信號會被檢測出來。每種堿基修飾事件都會使聚合酶的“停頓模式”PacBio Sequel產生微小差異,最終反映到熒 光脈沖信號的間隔上。除了甲基化修飾,還可以檢測5-hC、5-hmU、5-hU、1-mA、6-mA、8-oxoA、BPDE、6-mT、6-mG等堿基 修飾,甚至可以鑒別傳統亞硫酸氫鹽測序法無法區分的甲基化修飾和羥甲基化修飾。PacBio Sequel平臺可以在測序的同時即可檢測表 觀遺傳學修飾信息,只需對測序數據選擇合適的軟件即可分析堿基修飾信息。

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