16S rDNA測序

    16S rDNA基因是細菌上編碼rRNA相對應的DNA序列,存在于所有細菌的基因組中。該基因序列足夠長(包含約50個功能域)且具有高度的保守性和特異性。16s rDNA基因檢測技術已成為病原菌檢測和鑒定的一種強有力工具。隨著數據庫的不斷完善,應用該技術可以實現對病原菌進行快速、微量、準確簡便地分類鑒定和檢測。然而,受二代測序的讀長限制,目前的微生物多樣性研究僅檢測16S rDNA的某幾段高變區,物種分類也只能精確到“屬”的水平。

     天津生物芯片利用PacBio RSii三代測序平臺,可以無需PCR擴增,實現完全意義上的單分子擴增測序。16s作為鑒定物種分類的“分子鐘”基因,目前采用二代測序雖然可以測其保守區,但區分度一直受測序長度影響。而三代平臺的PacBio RS II的平均讀長為10-14Kb,16S rDNA長度大約為1500bp左右,因此結合該平臺測序可以成功測序獲得16S的全長序列,這樣在微生物鑒定方面注釋信息可靠度會更為精確。

測序策略

測序原理

首先,Adaptor(SMRTbells)加到擴增子的兩端。

然后測序引物與SMRTbells退火。緊接著DNA聚合酶結合到復合體上。

隨后聚合酶-擴增子-adaptor組成的復合體被固定到ZMWs中進行復制,產生核苷酸特異性的熒光信號。CCS使得聚合酶對環形鏈進行擴增,產生具有隨機錯誤的長讀長序列。

運行結束后,去除接頭(SMRTbell),單分子末端補齊,產生一條序列,CCS測序結果的單分子覆蓋度和準確度取決于擴增子和序列長度,擴增子越小,讀取長度越長,單分子覆蓋度和準確度就越高。

產品優勢

高通量:能同時分析群落中所有的微生物 高數據質量;

采用PacBio的CCS模式,對序列自我矯正,數據一致性準確率高 高分辨率;

分析16S rDNA全長,分類地位精確到“種” 無堿基偏好性,不受GC含量的影響 不需經過擴增,降低了儀器引起的測序錯誤率;

產品特點


Pacbio研究實例
  Mothur作者Patrick D Schloss在2015年最新的文章,詳細討論了16s不同區域/不同注釋數據庫/不同測序技術之間的比較。
以下是三代和二代,以及不同數據庫/不同測序區域,對測序注釋的影響比較:

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